Pseudotime Sexual Branch wild-type cells only
Gametocyte Development in Plasmodium berghei
Andrew Russell
May 17, 2021
1. Introduction and Aims
We have merged the two datasets together in GCSKO_merge_wt.Rmd. We also subsetted out the pre-sexual-branch and the sexual cells (male and female) and stored them in a Seurat object called tenx.justwt.integrated.sex Here, we will perform pseudotime analysis on the dataset and build modules of genes that show similar expression across this pseudotime.
2. Read in the data
Load/Install the Required Packages
[1] "patchwork is loaded correctly"
[1] "viridis is loaded correctly"
[1] "Seurat is loaded correctly"
[1] "cowplot is loaded correctly"
[1] "gridExtra is loaded correctly"
[1] "grid is loaded correctly"
[1] "Hmisc is loaded correctly"
[1] "reshape2 is loaded correctly"
[1] "dplyr is loaded correctly"Loading required package: circlize
========================================
circlize version 0.4.12
CRAN page: https://cran.r-project.org/package=circlize
Github page: https://github.com/jokergoo/circlize
Documentation: https://jokergoo.github.io/circlize_book/book/
If you use it in published research, please cite:
Gu, Z. circlize implements and enhances circular visualization
in R. Bioinformatics 2014.
This message can be suppressed by:
suppressPackageStartupMessages(library(circlize))
========================================[1] "circlize is loaded correctly"
[1] "monocle3 is loaded correctly"Loading required package: destiny
Attaching package: ‘destiny’
The following object is masked from ‘package:SummarizedExperiment’:
distance
The following object is masked from ‘package:GenomicRanges’:
distance
The following object is masked from ‘package:IRanges’:
distance[1] "destiny is loaded correctly"load data
## load sex only branch cells saved from GCSKO_Sex_Branch_Analysis.Rmd
## Restore the objects
## load sex branch dataset
tenx.justwt.integrated.sex <- readRDS("../data_to_export/tenx.justwt.integrated.sex.RDS")
## load full dataset
#tenx.mutant.integrated <- readRDS("../data_to_export/tenx.mutant.integrated.RDS")## add old pt values
## these values are calculated in hte GCSKO_pseudotime_allcells.Rmd script and so were added after the object was split into sex only.
#tenx.all <- readRDS("../data_to_export/tenx.mutant.integrated.RDS")
#tenx.all.meta <- as.data.frame(tenx.all@meta.data)
#tenx.all.meta <- tenx.all.meta[which(rownames(tenx.all.meta) %in% rownames(tenx.mutant.integrated.sex@meta.data)),]
#tenx.mutant.integrated.sex <- AddMetaData(tenx.mutant.integrated.sex, tenx.all.meta$old_pt_values, col.name = "old_pt_values")
## then remove these objects so they don't use up memory
#rm(tenx.all, tenx.all.meta)Add a meta.data column so that 10X is listed as WT:
## get cells that are filtered out
mutant_cells <- which(tenx.justwt.integrated.sex$experiment == "mutants")
## make extra column in plotting df
tenx.justwt.integrated.sex@meta.data$identity_name_combined <- "WT_10X"
tenx.justwt.integrated.sex@meta.data$identity_name_combined[mutant_cells] <- tenx.justwt.integrated.sex@meta.data$identity_name_updated[mutant_cells]
## check
table(tenx.justwt.integrated.sex@meta.data$identity_name_combined)
wild-type WT_10X
419 2398 ## create a list of our mutant gene IDs
list_of_mutant_genes <- c("PBANKA-0828000", "PBANKA-1302700", "PBANKA-1447900", "PBANKA-0102400", "PBANKA-0716500", "PBANKA-1435200", "PBANKA-1418100", "PBANKA-1144800", "PBANKA-0902300", "PBANKA-0413400", "PBANKA-1454800")Read in gene annotations
gene_annotations <- read.table("../data/Reference/GenesByTaxon_Summary.csv", header = TRUE, sep = ",", stringsAsFactors = TRUE)
dim(gene_annotations)[1] 5254 7## convert _ to -
gene_annotations$Gene.ID <- gsub("_", "-", gene_annotations$Gene.ID)3. Monocle on sex cells
calculate pseudotime and modules
Preparation
## extracts only 10x cells and also remove cluster 0 cells
wt_cells <- rownames(tenx.justwt.integrated.sex@meta.data[which(tenx.justwt.integrated.sex@meta.data$identity_name_combined == "WT_10X" & !tenx.justwt.integrated.sex@meta.data$seurat_clusters == "3"),])
# & !tenx.justwt.integrated.sex@meta.data$seurat_clusters == "6"
## make a new Seurat of this
seurat.object <-subset(tenx.justwt.integrated.sex, cells = wt_cells)
## check that this is the same as the pb_sex_filtered object
#data_test <- as(as.matrix(GetAssayData(pb_sex_filtered, assay = "RNA", slot = "data")), 'sparseMatrix')
#is.equal
#is.identical
## extract counts and pheno:
## the reason we use the integrated and then subsetted is because these cells have been normalised whereas the cells in pb_sex_filtered have not been normalised (well they have but with doublets in them)
## with 10x only cells: all.equal(as.data.frame(counts(monocle.object)), as.data.frame(as.matrix(GetAssayData(seurat.object, assay = "RNA", slot = "counts")))) returns TRUE and also returns true when you change the slot input to "counts" and use monocle to norm it with method "log"
data <- as(as.matrix(GetAssayData(seurat.object, assay = "RNA", slot = "counts")), 'sparseMatrix')
## make phenodata
pd <- data.frame(seurat.object@meta.data)
## keep only the columns that are relevant in metadata
#pData <- pd %>% select(orig.ident, nCount_RNA, nFeature_RNA)
## make gene metadata
fData <- data.frame(gene_short_name = row.names(data), row.names = row.names(data))
## Construct monocle cds
monocle.object <- new_cell_data_set(expression_data = data, cell_metadata = pd, gene_metadata = fData)
## preprocess
monocle.object = preprocess_cds(monocle.object, num_dim = 50, norm_method = "log")
### if using integrated data:
# norm_method = "none", alignment_group = "~ experiment"
## plot jack straw plot
#plot_pc_variance_explained(monocle.object)
#monocle.object = reduce_dimension(monocle.object, reduction_method = "UMAP", preprocess_method = "PCA", umap.metric = "euclidean", umap.n_neighbors = 50, umap.min_dist = 0.5, verbose = FALSE)
#plot_cells(monocle.object, color_cells_by="experiment")
## graph learning
## add UMAP from Seurat
monocle.object@int_colData@listData$reducedDims@listData[["UMAP"]] <- seurat.object@reductions[["umap"]]@cell.embeddings
## if you want the old UMAP from the original all cells one, use: "DIM_UMAP"
## cluster
## this is essential to run the learn_graph function later on
monocle.object = cluster_cells(monocle.object)
## plot initial clustering by monocle
#plot_cells(monocle.object, color_cells_by="cluster", group_cells_by="partition", x = 2, y = 1)
## map pseudotime
monocle.object = learn_graph(monocle.object, learn_graph_control=list(ncenter=550, minimal_branch_len = 30), use_partition = FALSE)
|
| | 0%
|
|================================================================================================================| 100%# learn_graph_control=list(ncenter=500) - play with this parameter - lower tends to give fewer branches and higher tends to give more
# 500 - old analysis
# 250 - new analysis
## Plot cells
plot_cells(monocle.object, color_cells_by="monocle_sex", group_cells_by="partition", x = 1, y = 2)`select_()` was deprecated in dplyr 0.7.0.
Please use `select()` instead.The `add` argument of `group_by()` is deprecated as of dplyr 1.0.0.
Please use the `.add` argument instead.
Redefine the identities of the male and female cells
male
# monocle.object_male <- choose_graph_segments(monocle.object)female
# monocle.object_female <- choose_graph_segments(monocle.object)bipotential
#monocle.object_bipot <- choose_graph_segments(monocle.object)asexual
#monocle.object_asex <- choose_graph_segments(monocle.object)asexual fate
#monocle.object_asex_fate <- choose_graph_segments(monocle.object)check
# df_freq <- data.frame(table(c(colnames(monocle.object_male), colnames(monocle.object_female), colnames(monocle.object_bipot), colnames(monocle.object_asex), colnames(monocle.object_asex_fate))))
# paste("number of cells in seurat object is", length(colnames(monocle.object)), ". The number of cells selected here with an identitity is", dim(df_freq)[1])
# df_freq <- df_freq[df_freq$Freq > 1, ]
# df_freqInspect where these missing cells are:
# '%ni%' <- Negate('%in%')
#
# not_assigned_cells <- colnames(monocle.object)[colnames(monocle.object) %ni% c(colnames(monocle.object_male), colnames(monocle.object_female), colnames(monocle.object_bipot), colnames(monocle.object_asex), colnames(monocle.object_asex_fate))]
#
# DimPlot(seurat.object, repel = TRUE, label.size = 5, pt.size = 0.5, cells.highlight = not_assigned_cells, dims = c(2,1), reduction = "DIM_UMAP") +
# coord_fixed() +
# scale_color_manual(values=c("#000000", "#f54e1e"))# ## create annotation dataframe from these results:
# df_monocle_sexes <- rbind(data.frame("cell_name" = colnames(monocle.object_male), "sex" = rep("Male", length(colnames(monocle.object_male)))),
# data.frame("cell_name" = colnames(monocle.object_female), "sex" = rep("Female", length(colnames(monocle.object_female)))),
# data.frame("cell_name" = colnames(monocle.object_bipot), "sex" = rep("Bipotential", length(colnames(monocle.object_bipot)))),
# data.frame("cell_name" = colnames(monocle.object_asex), "sex" = rep("Asexual", length(colnames(monocle.object_asex)))),
# data.frame("cell_name" = colnames(monocle.object_asex_fate), "sex" = rep("Asexual_Fate", length(colnames(monocle.object_asex_fate)))),
# data.frame("cell_name" = not_assigned_cells, "sex" = rep("Unassigned", length(not_assigned_cells)))
# )
#
# dim(df_monocle_sexes)
#
# ## order like the metadata
# df_monocle_sexes <- df_monocle_sexes[match(rownames(monocle.object@colData), df_monocle_sexes$cell_name), ]
#
# ## add this back into the monocle object
# monocle.object@colData$Sexes_monocle <- df_monocle_sexes$sexPseudotime Calculation
## Order the cells and calculate pseudotime
monocle.object = order_cells(monocle.object)Loading required package: shiny
Listening on http://127.0.0.1:6168## Plot
umap_pt <- plot_cells(monocle.object, color_cells_by = "pseudotime", label_cell_groups=FALSE, cell_size = 1, x = 1, y = 2, label_branch_points=FALSE, label_leaves=FALSE, label_groups_by_cluster=FALSE, label_roots = FALSE) +
coord_fixed() +
theme_void() +
labs(title = "Pseudotime") +
theme(plot.title = element_text(hjust = 0.5, size=15), legend.position="bottom", legend.title=element_text (size=10), legend.text=element_text(size=10)) +
guides(colour = guide_colourbar(barwidth = 10, barheight = 0.5, title = "Pseudotime"))
## view
umap_pt
Check how well it correlates with the original pseudotime
when pseudotime was calculated on the whole object
library(ggpubr)
Attaching package: ‘ggpubr’
The following object is masked from ‘package:cowplot’:
get_legend## extract pseudotime values:
pt_values_new <- as.data.frame(pseudotime(monocle.object, reduction_method = "UMAP"))
pt_values_new$cell_name <- rownames(pt_values_new)
meta_data_df <- as.data.frame(monocle.object@colData)
meta_data_df$cell_name <- rownames(meta_data_df)
meta_data_df <- merge(meta_data_df, pt_values_new, by = "cell_name")
names(meta_data_df)[ncol(meta_data_df)]<- "pt"
ggplot(meta_data_df, aes(x = old_pt_values, y = pt, colour = monocle_sex)) +
geom_point() +
geom_smooth(method = "lm", se = FALSE) +
theme_classic() + stat_cor(method = "pearson")
Module Construction
## find genes that change as a function of pt:
monocle.object_pr_test_res <- graph_test(monocle.object, neighbor_graph="principal_graph", cores=8, expression_family = "negbinomial")Registered S3 method overwritten by 'spdep':
method from
plot.mst ape
| | 0%, ETA NA
| | 0%, ETA 07:03
| | 0%, ETA 03:36
| | 0%, ETA 02:52
| | 0%, ETA 02:28
| | 0%, ETA 02:19
| | 0%, ETA 02:02
| | 0%, ETA 01:51
| | 0%, ETA 01:42
| | 0%, ETA 01:37
| | 0%, ETA 01:36
| | 0%, ETA 01:32
| | 0%, ETA 01:32
| | 0%, ETA 01:30
| | 0%, ETA 01:27
| | 0%, ETA 01:37
| | 0%, ETA 01:38
| | 0%, ETA 01:39
| | 0%, ETA 01:37
| | 0%, ETA 01:40
| | 0%, ETA 01:38
| | 0%, ETA 01:34
| | 0%, ETA 01:32
| | 0%, ETA 01:28
| | 0%, ETA 01:26
|= | 1%, ETA 01:26
|= | 1%, ETA 01:25
|= | 1%, ETA 01:22
|= | 1%, ETA 01:21
|= | 1%, ETA 01:19
|= | 1%, ETA 01:17
|= | 1%, ETA 01:17
|= | 1%, ETA 01:18
|= | 1%, ETA 01:14
|= | 1%, ETA 01:12
|= | 1%, ETA 01:12
|= | 1%, ETA 01:09
|= | 1%, ETA 01:08
|= | 1%, ETA 01:07
|= | 1%, ETA 01:06
|= | 1%, ETA 01:06
|= | 1%, ETA 01:05
|= | 1%, ETA 01:04
|= | 1%, ETA 01:04
|= | 1%, ETA 01:03
|= | 1%, ETA 01:05
|= | 1%, ETA 01:05
|= | 1%, ETA 01:03
|= | 1%, ETA 01:03
|= | 1%, ETA 01:02
|= | 1%, ETA 01:01
|= | 1%, ETA 01:02
|= | 1%, ETA 01:01
|= | 1%, ETA 01:02
|= | 1%, ETA 01:00
|= | 1%, ETA 01:00
|= | 1%, ETA 01:00
|= | 1%, ETA 00:59
|= | 1%, ETA 00:59
|= | 1%, ETA 00:59
|= | 1%, ETA 00:58
|= | 1%, ETA 00:58
|= | 1%, ETA 00:58
|= | 1%, ETA 00:57
|= | 1%, ETA 00:57
|= | 1%, ETA 00:57
|= | 1%, ETA 00:57
|= | 1%, ETA 00:56
|== | 1%, ETA 00:56
|== | 2%, ETA 00:56
|== | 2%, ETA 00:55
|== | 2%, ETA 00:55
|== | 2%, ETA 00:56
|== | 2%, ETA 00:55
|== | 2%, ETA 00:55
|== | 2%, ETA 00:54
|== | 2%, ETA 00:54
|== | 2%, ETA 00:54
|== | 2%, ETA 00:53
|== | 2%, ETA 00:53
|== | 2%, ETA 00:53
|== | 2%, ETA 00:52
|== | 2%, ETA 00:52
|== | 2%, ETA 00:51
|== | 2%, ETA 00:52
|== | 2%, ETA 00:52
|== | 2%, ETA 00:52
|== | 2%, ETA 00:52
|== | 2%, ETA 00:52
|== | 2%, ETA 00:52
|== | 2%, ETA 00:52
|== | 2%, ETA 00:52
|== | 2%, ETA 00:52
|== | 2%, ETA 00:51
|== | 2%, ETA 00:51
|== | 2%, ETA 00:51
|== | 2%, ETA 00:51
|== | 2%, ETA 00:51
|== | 2%, ETA 00:51
|== | 2%, ETA 00:51
|== | 2%, ETA 00:51
|== | 2%, ETA 00:51
|== | 2%, ETA 00:50
|== | 2%, ETA 00:50
|== | 2%, ETA 00:50
|== | 2%, ETA 00:49
|== | 2%, ETA 00:49
|== | 2%, ETA 00:49
|== | 2%, ETA 00:49
|== | 2%, ETA 00:49
|== | 2%, ETA 00:49
|=== | 2%, ETA 00:49
|=== | 3%, ETA 00:49
|=== | 3%, ETA 00:49
|=== | 3%, ETA 00:49
|=== | 3%, ETA 00:49
|=== | 3%, ETA 00:49
|=== | 3%, ETA 00:49
|=== | 3%, ETA 00:49
|=== | 3%, ETA 00:48
|=== | 3%, ETA 00:48
|=== | 3%, ETA 00:48
|=== | 3%, ETA 00:48
|=== | 3%, ETA 00:48
|=== | 3%, ETA 00:47
|=== | 3%, ETA 00:47
|=== | 3%, ETA 00:47
|=== | 3%, ETA 00:47
|=== | 3%, ETA 00:47
|=== | 3%, ETA 00:46
|=== | 3%, ETA 00:46
|=== | 3%, ETA 00:46
|=== | 3%, ETA 00:46
|=== | 3%, ETA 00:46
|=== | 3%, ETA 00:46
|=== | 3%, ETA 00:45
|=== | 3%, ETA 00:45
|=== | 3%, ETA 00:45
|=== | 3%, ETA 00:45
|=== | 3%, ETA 00:45
|=== | 3%, ETA 00:44
|=== | 3%, ETA 00:45
|=== | 3%, ETA 00:45
|=== | 3%, ETA 00:44
|=== | 3%, ETA 00:44
|=== | 3%, ETA 00:44
|=== | 3%, ETA 00:44
|=== | 3%, ETA 00:43
|=== | 3%, ETA 00:43
|=== | 3%, ETA 00:43
|=== | 3%, ETA 00:43
|=== | 3%, ETA 00:43
|==== | 3%, ETA 00:43
|==== | 3%, ETA 00:43
|==== | 4%, ETA 00:43
|==== | 4%, ETA 00:43
|==== | 4%, ETA 00:43
|==== | 4%, ETA 00:43
|==== | 4%, ETA 00:43
|==== | 4%, ETA 00:43
|==== | 4%, ETA 00:42
|==== | 4%, ETA 00:42
|==== | 4%, ETA 00:42
|==== | 4%, ETA 00:42
|==== | 4%, ETA 00:42
|==== | 4%, ETA 00:42
|==== | 4%, ETA 00:41
|==== | 4%, ETA 00:41
|==== | 4%, ETA 00:42
|==== | 4%, ETA 00:41
|==== | 4%, ETA 00:41
|==== | 4%, ETA 00:41
|==== | 4%, ETA 00:41
|==== | 4%, ETA 00:41
|==== | 4%, ETA 00:41
|==== | 4%, ETA 00:41
|==== | 4%, ETA 00:40
|==== | 4%, ETA 00:40
|==== | 4%, ETA 00:40
|==== | 4%, ETA 00:40
|==== | 4%, ETA 00:40
|==== | 4%, ETA 00:40
|==== | 4%, ETA 00:40
|==== | 4%, ETA 00:41
|==== | 4%, ETA 00:41
|==== | 4%, ETA 00:42
|==== | 4%, ETA 00:42
|==== | 4%, ETA 00:42
|==== | 4%, ETA 00:42
|==== | 4%, ETA 00:42
|==== | 4%, ETA 00:41
|==== | 4%, ETA 00:42
|==== | 4%, ETA 00:41
|==== | 4%, ETA 00:41
|==== | 4%, ETA 00:41
|==== | 4%, ETA 00:41
|==== | 4%, ETA 00:41
|===== | 4%, ETA 00:41
|===== | 4%, ETA 00:41
|===== | 5%, ETA 00:41
|===== | 5%, ETA 00:41
|===== | 5%, ETA 00:41
|===== | 5%, ETA 00:41
|===== | 5%, ETA 00:41
|===== | 5%, ETA 00:41
|===== | 5%, ETA 00:41
|===== | 5%, ETA 00:41
|===== | 5%, ETA 00:41
|===== | 5%, ETA 00:41
|===== | 5%, ETA 00:41
|===== | 5%, ETA 00:41
|===== | 5%, ETA 00:41
|===== | 5%, ETA 00:41
|===== | 5%, ETA 00:41
|===== | 5%, ETA 00:41
|===== | 5%, ETA 00:41
|===== | 5%, ETA 00:41
|===== | 5%, ETA 00:41
|===== | 5%, ETA 00:41
|===== | 5%, ETA 00:41
|===== | 5%, ETA 00:40
|===== | 5%, ETA 00:41
|===== | 5%, ETA 00:41
|===== | 5%, ETA 00:41
|===== | 5%, ETA 00:41
|===== | 5%, ETA 00:41
|===== | 5%, ETA 00:41
|===== | 5%, ETA 00:41
|===== | 5%, ETA 00:41
|===== | 5%, ETA 00:41
|===== | 5%, ETA 00:41
|===== | 5%, ETA 00:41
|===== | 5%, ETA 00:41
|===== | 5%, ETA 00:41
|===== | 5%, ETA 00:41
|===== | 5%, ETA 00:41
|===== | 5%, ETA 00:41
|===== | 5%, ETA 00:40
|===== | 5%, ETA 00:41
|===== | 5%, ETA 00:41
|===== | 5%, ETA 00:41
|===== | 5%, ETA 00:41
|====== | 5%, ETA 00:40
|====== | 5%, ETA 00:40
|====== | 5%, ETA 00:40
|====== | 6%, ETA 00:40
|====== | 6%, ETA 00:40
|====== | 6%, ETA 00:40
|====== | 6%, ETA 00:40
|====== | 6%, ETA 00:40
|====== | 6%, ETA 00:40
|====== | 6%, ETA 00:40
|====== | 6%, ETA 00:40
|====== | 6%, ETA 00:40
|====== | 6%, ETA 00:40
|====== | 6%, ETA 00:40
|====== | 6%, ETA 00:40
|====== | 6%, ETA 00:40
|====== | 6%, ETA 00:40
|====== | 6%, ETA 00:40
|====== | 6%, ETA 00:40
|====== | 6%, ETA 00:40
|====== | 6%, ETA 00:40
|====== | 6%, ETA 00:40
|====== | 6%, ETA 00:40
|====== | 6%, ETA 00:40
|====== | 6%, ETA 00:40
|====== | 6%, ETA 00:40
|====== | 6%, ETA 00:40
|====== | 6%, ETA 00:40
|====== | 6%, ETA 00:40
|====== | 6%, ETA 00:40
|====== | 6%, ETA 00:40
|====== | 6%, ETA 00:40
|====== | 6%, ETA 00:40
|====== | 6%, ETA 00:40
|====== | 6%, ETA 00:40
|====== | 6%, ETA 00:40
|====== | 6%, ETA 00:40
|====== | 6%, ETA 00:40
|====== | 6%, ETA 00:40
|====== | 6%, ETA 00:40
|====== | 6%, ETA 00:40
|====== | 6%, ETA 00:40
|====== | 6%, ETA 00:40
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|=================================================================================================| 100%, Elapsed 00:34# explains expression family - https://cole-trapnell-lab.github.io/monocle3/docs/differential/ - results were same for either defauly or negbinomial
## find significant genes
## I used 0.05 previously in all cells
## 2884 w. p = 0.01, 3260 w. p = 0.05
pr_deg_ids <- row.names(subset(monocle.object_pr_test_res, q_value < 0.05))
## collect into modules
gene_module_df_sex <- find_gene_modules(monocle.object[pr_deg_ids,], resolution=c(10^seq(-6,2)), random_seed = 1234)
## how many genes in modules?
dim(gene_module_df_sex)[1] 3528 5[1] "there are 23 modules"Plot Modules
General Module Composition
Make a dataframe to plot by aggregating clusters vs. modules
## make cell group df
cell_group_df <- tibble::tibble(cell=row.names(colData(monocle.object)), cell_group=colData(monocle.object)$seurat_clusters)
## make plotting df
#agg_mat <- aggregate_gene_expression(monocle.object, gene_module_df_sex, cell_group_df)Find out how many genes there are per total so we can add this to the plot
## how many genes per module?
genes_per_module <- as.data.frame(table(gene_module_df_sex$module))
genes_per_moduleFind out which modules our mutant genes reside in
## create a list of our mutant gene IDs
list_of_mutant_genes <- c("PBANKA-0828000", "PBANKA-1302700", "PBANKA-1447900", "PBANKA-0102400", "PBANKA-0716500", "PBANKA-1435200", "PBANKA-1418100", "PBANKA-0902300", "PBANKA-0413400", "PBANKA-1454800")
## make a dataframe to convert the gene IDs into actual IDs
ss2_mutants_final <- readRDS("../data_to_export/ss2_mutants_final.RDS")
df_mutant_ids <- as.data.frame(unique(cbind(ss2_mutants_final@meta.data$identity_gene_updated, ss2_mutants_final@meta.data$identity_updated, ss2_mutants_final@meta.data$identity_name_updated)))[-c(2),]
rm(ss2_mutants_final)
# remove the "820" bit on 10
df_mutant_ids$V1 <- gsub("_820", "", df_mutant_ids$V1)
# change the underscore (_) to a dash (-) in gene IDs
df_mutant_ids$V1 <- gsub("_", "-", df_mutant_ids$V1)
names(df_mutant_ids) <- c("gene_ID", "mutant_identity", "mutant_identity_2")
## subset modules df to include only mutant gene IDs
df_mutant_gene_modules <- as.data.frame(gene_module_df_sex[which(gene_module_df_sex$id %in% list_of_mutant_genes),])
names(df_mutant_gene_modules)[1] <- "gene_ID"
## merge dataframes
df_mutant_gene_modules <- merge(df_mutant_gene_modules, df_mutant_ids, by = "gene_ID")
## Inspect
df_mutant_gene_modules[order(df_mutant_gene_modules$module), ]so modules of interest are:
table(df_mutant_gene_modules$module)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
0 0 3 0 0 0 0 2 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 Which modules do other genes of interest lie in?:
## landmark genes (genes of interest)
# AP2G - PBANKA-1437500
# AP2 - PBANKA-0909600 - from poran paper
# AP2G-2 - PBANKA-1034300
# ccp2 - "PBANKA-1319500" - female 820
# p25 - "PBANKA-0515000" - female
# p28 - "PBANKA-0514900" - female
# ccp3 - "PBANKA-1035200" - female - https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5909122/
# nek4 - "PBANKA-0616700" - female
# ap2-fg - "PBANKA-1415700" - female
# dozi - "PBANKA-1217700" - female
# MG1 - "PBANKA-0416100" - male 820
# hap2 - "PBANKA-1212600" - male
# MAPK2 - "PBANKA-0933700" - male
# nek1 - "PBANKA-1443000" - male
# cdpk4 - "PBANKA-0615200" - male
## create a list of landmark genes
list_of_landmark_genes <- c("PBANKA-1437500",
"PBANKA-0909600",
"PBANKA-1034300",
"PBANKA-1319500",
"PBANKA-0515000",
"PBANKA-0514900",
"PBANKA-1035200",
"PBANKA-0616700",
"PBANKA-1415700",
"PBANKA-1217700",
"PBANKA-0416100",
"PBANKA-1212600",
"PBANKA-0933700",
"PBANKA-1443000",
"PBANKA-0615200")
name_of_landmark_genes <- c("AP2-G",
"AP2_poran",
"AP2-G2",
"ccp2",
"p25",
"p28",
"ccp3",
"nek4",
"ap2-fg",
"DOZI",
"mg1",
"hap2",
"mapk2",
"nek1",
"cdpk4")
## make a df
name_of_landmark_genes <- data.frame("gene_name" = name_of_landmark_genes, "id" = list_of_landmark_genes)
## make dataframe
df_landmark_gene_modules <- gene_module_df_sex[which(gene_module_df_sex$id %in% list_of_landmark_genes),]
## merge dataframes
df_landmark_gene_modules <- merge(df_landmark_gene_modules, name_of_landmark_genes, by = "id")
## inspect
df_landmark_gene_modules[order(df_landmark_gene_modules$module), ]enrichment of screen hits in modules
## read in screen hits
library("readxl")
screen_hits <- read_excel("../data/Screen/Modules_Clusters_Phenotypes.xlsx")
## get only hits
screen_hits_selected <- screen_hits[which(screen_hits$`Gam phenotype screen` == "Both" | screen_hits$`Gam phenotype screen` == "Females" | screen_hits$`Gam phenotype screen` == "Males"), ]
## extract gene IDs
gene_hits <- screen_hits_selected$`new gene ID`
## change the underscore to a dash
gene_hits <- gsub("_", "-", gene_hits)
## find out which modules they are in
df_hits_gene_modules <- gene_module_df_sex[which(gene_module_df_sex$id %in% gene_hits),]
print("screen hits by module")[1] "screen hits by module"table(df_hits_gene_modules$module)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
1 1 4 1 0 0 3 3 2 1 0 0 6 1 0 0 0 1 1 0 2 0 0 ## get the number genes screened in that module
screen_hits_screened <- screen_hits[which(screen_hits$`Gam phenotype screen` == "Both" | screen_hits$`Gam phenotype screen` == "Females" | screen_hits$`Gam phenotype screen` == "Males" | screen_hits$`Gam phenotype screen` == "None" | screen_hits$`Gam phenotype screen` == "male not enough power"), ]
## extract gene IDs
genes_screened <- screen_hits_screened$`new gene ID`
## change the underscore to a dash
genes_screened <- gsub("_", "-", genes_screened)
## find out which modules they are in
df_screened_gene_modules <- gene_module_df_sex[which(gene_module_df_sex$id %in% genes_screened),]
print("total genes screened in this module")[1] "total genes screened in this module"table(df_screened_gene_modules$module)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
111 45 57 31 73 34 32 47 23 24 41 16 43 25 49 20 11 32 20 22 17 19 9 ## make a table with this info
pc_screened <- data.frame(hits = table(df_hits_gene_modules$module), screened = table(df_screened_gene_modules$module))[,-3]
names(pc_screened) <- c("module", "hits", "screened")
pc_screened$pc <- (pc_screened$hits /pc_screened$screened)*100
## view
pc_screenedFurther investigation of screen hits
## rename df
df_screen_hits_selected <- as.data.frame(screen_hits_selected)
df_screen_hits_selected$'new gene ID' <- gsub("_", "-", df_screen_hits_selected$'new gene ID')
names(df_screen_hits_selected)[2] <- "id"
df_gene_module_df_sex <- as.data.frame(gene_module_df_sex)
## merge dfs together
screen_hits_modules <- merge(df_screen_hits_selected, df_gene_module_df_sex, by = "id")
## view
screen_hits_modules## change the row order to match the heatmap later
pc_screened$module <- factor(pc_screened$module, levels = rev(c("10", "9", "17", "4", "2", "6", "12", "14",
"21", "7",
"22", "23","13","16", "18", "19", "11", "15", "5",
"20", "8", "3", "1"
)))
h1 <- ggplot(data = pc_screened, mapping = aes(x = module, fill=pc)) +
geom_bar(col = "#FFFFFF", width = 1)+
theme_void() +
theme(panel.spacing.x = unit(1, "mm")) +
scale_fill_continuous_sequential(palette = "Greens") +
coord_flip()
legend <- get_legend(h1)
h1 <- h1 + theme(legend.position = "none")
screen_annotation <- plot_grid(h1, legend, nrow = 1, rel_widths = c(10, 1.5))
screen_annotation
ggsave("../images_to_export/screen_annotation.png", plot = screen_annotation, device = "png", path = NULL, scale = 1, width = 10, height = 10, units = "cm", dpi = 300, limitsize = TRUE)significance test
test vikash vs my dataframe
## kasia's table for comparison
vikash <- read.delim("../bulk_rna-seq/enrichment/Kasia new cluster enrichment for Vikash.txt", sep = "\t", header = TRUE)
dim(vikash)[1] 1006 3## read in screen hits
library("readxl")
screen_hits <- read_excel("../data/Screen/Modules_Clusters_Phenotypes.xlsx")
dim(screen_hits)[1] 4785 11combined <- merge(screen_hits[which(screen_hits$`Gam phenotype screen` == "Both" | screen_hits$`Gam phenotype screen` == "Females" | screen_hits$`Gam phenotype screen` == "Males"), ], vikash[!vikash$cons.phenotype == "None", ], by.x = "new gene ID", by.y = "new.gene.ID", all.x = TRUE)
dim(combined)[1] 41 13set up df for python
## read in modules
modules <- as.data.frame(gene_module_df_sex)
## take cols of interest
modules <- modules[ ,c("id", "module"), drop = FALSE]
## change the underscore to a dash
modules$id <- gsub("-", "_", modules$id)
## read in phenotypes from screen
screen_hits <- read_excel("../data/Screen/Modules_Clusters_Phenotypes.xlsx")
screen_hits_to_merge <- as.data.frame(screen_hits)
screen_hits_to_merge <- screen_hits_to_merge[ ,c("new gene ID", "Gam phenotype screen")]
## merge togerther to create final df
input_for_enrichment <- merge(modules, screen_hits_to_merge, by.x = "id", by.y = "new gene ID", all.x = TRUE)
names(input_for_enrichment) <- c("new gene ID", "Cluster", "cons phenotype")
## modify to match vikash table
## remove NA values
input_for_enrichment <- input_for_enrichment[!is.na(input_for_enrichment$`cons phenotype`), ]
## change the malenot enough power to none
input_for_enrichment[input_for_enrichment$`cons phenotype` == "male not enough power", ]$`cons phenotype` <- "None"
##clean up
rm(screen_hits_to_merge)do significance test in python - update this to R at a later date - Vikash wrote this for enrichment of screen hits in bulk data
import os
import pandas as pd
from scipy.stats import hypergeom ## for hypergeomtric distributions
import numpy as np
import statsmodels.stats.multitest as mtest ## for multiple hypothesis testing
current_folder = os.getcwd() ## current directory path
def apply_enrich(tmp,sex_gene_list,outfile):
## groupby along Phenotyepes
#First argumnet: temperory dataframe
#Second argument: list of male-specific genes
#Third argumnet: file where we store enrichment analysis
M=len(tmp.index) # total number of genes
pvals=[] # list for storing pvalues
n_list=[] # store number of genes in cluster
x_list=[] ## store number of sex-specific genes in cluster
genes=[] ## we store genes (sex-specifc gene ids)
clusters=[] ## store cluster number
## group clusters
for k,v in tmp.groupby([ 'Cluster']).indices.items():
## print(k, len(v))
clusters.append(k) ## store cluster number
clust_genes=set(tmp.index[v].to_list()) ## genes in the cluster
sex_gene_in_clust= set(sex_gene_list)& clust_genes ## how many sex-specific genes are found in cluster
## how many are in phenoype
M=M ## total genes
N=len(sex_gene_list) ## sex-specific genes
n=len(clust_genes) ## total number of cluster genes
rv = hypergeom(M, n, N) ## hypergeometric distributions
x=len(sex_gene_in_clust) ## number of sex-specific genes in cluster
## for p-value we need to get summation of all probalities greater than > x
pval= 1-rv.cdf(x)
pvals.append(pval)
n_list.append(n)
x_list.append(x)
genes.append(', '.join(sex_gene_in_clust))
fdr=mtest.multipletests(pvals, alpha=0.05, method='fdr_bh')
enrich={'Cluster':clusters, 'pvals':pvals,'cluster_size':n_list,'# of genes found in cluster':x_list,'genes':genes,'FDR':fdr[1]}
## create enrichment table
enrich_df=pd.DataFrame.from_dict(enrich)
enrich_soreted=enrich_df.sort_values(by=['pvals'],ascending=True)
enrich_soreted.to_csv(outfile,sep='\t',index=None)
def enrich_cluster_final():
''' Calculate p-value and FDR using enrichment analysis. We used hypergeometric test'''
### input file (provided by Oliver): this file has 3 columns
# First column: 'new gene ID'
# Second column: 'Cluster'
# Third column: 'cons phenotype'
##
#input_file=current_folder+'/Kasia new cluster enrichment for Vikash.txt'
#df=pd.read_csv(input_file,sep='\t')## input file as a dataframe
df = r.input_for_enrichment
df
#df=df.fillna('NA') ## nan is fill with NA
# df['consensus phenotype']=df['consensus phenotype'].str.replace('None','NA')
tmp=df.copy() ## this is the temperory data frame same as a original dataframe
tmp.set_index('new gene ID',inplace=True) ## make gene ids as index
## seprate the dataframes according sex-specific phenotypes
male_df=tmp[(tmp['cons phenotype']== 'Males')]
female_df=tmp[(tmp['cons phenotype']== 'Females')]
both_df=tmp[(tmp['cons phenotype']== 'Both')]
## enrichment analysis for male
outfile=current_folder+'/../data_to_export/module_enrichment_results/Module_enrichment_gametocyte_male.txt'
#First argumnet: temperory dataframe
#Second argument: list of male-specific genes
#Third argumnet: file where we store enrichment analysis
apply_enrich(tmp,male_df.index.to_list(),outfile)
## enrichment analysis for female: similar as male
outfile=current_folder+'/../data_to_export/module_enrichment_results/Module_enrichment_gametocyte_female.txt'
apply_enrich(tmp ,female_df.index.to_list(),outfile)
## enrichment analysis for both sexes: : similar as male
outfile=current_folder+'/../data_to_export/module_enrichment_results/Module_enrichment_gametocyte_both.txt'
apply_enrich(tmp,both_df.index.to_list(),outfile)
if __name__ == '__main__':
enrich_cluster_final()DOZI-regulated genes
Find out how many of the genes in each module has a DOZI-regulated gene
OLD LIST FROM KENT PAPER
DOZI_regulated_genes <-
read.csv(file = "../data/Reference/DOZI_regulated_genes.csv", header = TRUE)
## extract gene IDs
dozi_genes <- DOZI_regulated_genes[DOZI_regulated_genes$DOZI_regulated. == "YES", ]$Gene_ID_PB
## change the underscore to a dash
dozi_genes <- gsub("_", "-", dozi_genes)
## find out which modules they are in
df_dozi_gene_modules <- gene_module_df_sex[which(gene_module_df_sex$id %in% dozi_genes),]
print("dozi genes by module")[1] "dozi genes by module"table(df_dozi_gene_modules$module)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
1 13 5 8 83 5 5 4 3 7 10 11 9 6 35 7 3 14 9 4 3 5 3 ## DOZI
guerreiro <- read.csv(file = "../data/Reference/raw_data_and_merging_scripts/Guerreiro_2014.csv", header = TRUE)
guerreiro <- guerreiro[, c(1, 9,10,11)]
names(guerreiro) <- c("id", "CITH", "DOZI", "CITH_and_DOZI")
## change old gene IDs
old_ids <- read.csv(file = "../data/Reference/raw_data_and_merging_scripts/New_to_old_gene_ids.csv", header = FALSE)
## Get only 1 to 1 conversions
old_ids <- old_ids[old_ids$V3 == "",]
old_ids <- old_ids[ , c(1,2)]
names(old_ids) <- c("new", "old")
guerreiro_new <- merge(guerreiro, old_ids, by.x = "id", by.y = "old", all.x = TRUE)
guerreiro_new <- guerreiro_new[-which(is.na(guerreiro_new$new)), ]
## change the underscore to a dash
guerreiro_new$new <- gsub("_", "-", guerreiro_new$new)
## if you want only discovered in both
#guerreiro_hits <- guerreiro_new[guerreiro_new$CITH_and_DOZI == 2, ]
## to get all genes with a pullldown
guerreiro_hits <- guerreiro_new[!guerreiro_new$CITH_and_DOZI == 0, ]
dozi_genes <- guerreiro_hits$new
## find out which modules they are in
df_dozi_gene_modules <- gene_module_df_sex[which(gene_module_df_sex$id %in% dozi_genes),]
print("dozi genes by module")[1] "dozi genes by module"table(df_dozi_gene_modules$module)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
26 32 21 23 129 19 20 13 20 21 21 20 20 25 48 14 8 28 23 11 8
22 23
10 10 get as a percentage
## make a table with the total number of genes in each module
test <- as.data.frame(table(gene_module_df_sex$module), stringsAsFactors=FALSE)
## reorder rows by module number
test <- test[order(as.numeric(test$Var1)),]
## combine the total number of dozi genes per module with the total number of genes per module
pc_screened <- data.frame(dozi = table(df_dozi_gene_modules$module), total = test)[,-3]
names(pc_screened) <- c("module", "dozi_genes_per_module", "total_genes_per_module")
## calculate percentage
pc_screened$pc <- (pc_screened$dozi_genes_per_module /pc_screened$total_genes_per_module)*100
## view
pc_screened## change row order:
row.order <- c("10", "9", "17", "4", "2", "6", "12", "14",
"21", "7",
"22", "23","13","16", "18", "19", "11", "15", "5",
"20", "8", "3", "1"
)
## change the module to a string
#pc_screened$module <- as.numeric(as.character(pc_screened$module))
#pc_screened$module <- as.factor(pc_screened$module)
#pc_screened <- pc_screened[match(row.order, pc_screened$module), ]
pc_screened$module <- factor(pc_screened$module, levels = rev(c("10", "9", "17", "4", "2", "6", "12", "14",
"21", "7",
"22", "23","13","16", "18", "19", "11", "15", "5",
"20", "8", "3", "1"
)))
h1 <- ggplot(data = pc_screened, mapping = aes(x = module, fill=pc)) +
geom_bar(col = "#FFFFFF", width = 1)+
theme_void() +
theme(panel.spacing.x = unit(1, "mm")) +
scale_fill_continuous_sequential(palette = "Blues") +
coord_flip()
legend <- get_legend(h1)
h1 <- h1 + theme(legend.position = "none")
dozi_annotation <- plot_grid(h1, legend, nrow = 1, rel_widths = c(10, 1.5))
dozi_annotation
ggsave("../images_to_export/dozi_annotation.png", plot = dozi_annotation, device = "png", path = NULL, scale = 1, width = 10, height = 10, units = "cm", dpi = 300, limitsize = TRUE)set up df for python
## read in modules
modules <- as.data.frame(gene_module_df_sex)
## take cols of interest
modules <- modules[ ,c("id", "module"), drop = FALSE]
## change the underscore to a dash
modules$id <- gsub("-", "_", modules$id)
## read in phenotypes from screen
screen_hits_to_merge <- as.data.frame(guerreiro_hits)
## create new col
screen_hits_to_merge$phenotype <- NA
screen_hits_to_merge[screen_hits_to_merge$CITH == 1, ]$phenotype <- "CITH"
screen_hits_to_merge[screen_hits_to_merge$DOZI== 1, ]$phenotype <- "DOZI"
screen_hits_to_merge[screen_hits_to_merge$CITH_and_DOZI == 2, ]$phenotype <- "CITH_and_DOZI"
screen_hits_to_merge <- screen_hits_to_merge[ ,c("new", "phenotype")]
## change the underscore to a dash
screen_hits_to_merge$new <- gsub("-", "_", screen_hits_to_merge$new)
## merge togerther to create final df
input_for_enrichment <- merge(modules, screen_hits_to_merge, by.x = "id", by.y = "new", all.x = TRUE)
names(input_for_enrichment) <- c("new gene ID", "Cluster", "cons phenotype")
## modify to match vikash table
## remove NA values
input_for_enrichment <- input_for_enrichment[!is.na(input_for_enrichment$`cons phenotype`), ]
##clean up
rm(screen_hits_to_merge)do significance test in python - update this to R at a later date - Vikash wrote this for enrichment of screen hits in bulk data
import os
import pandas as pd
from scipy.stats import hypergeom ## for hypergeomtric distributions
import numpy as np
import statsmodels.stats.multitest as mtest ## for multiple hypothesis testing
current_folder = os.getcwd() ## current directory path
def apply_enrich(tmp,sex_gene_list,outfile):
## groupby along Phenotyepes
#First argumnet: temperory dataframe
#Second argument: list of male-specific genes
#Third argumnet: file where we store enrichment analysis
M=len(tmp.index) # total number of genes
pvals=[] # list for storing pvalues
n_list=[] # store number of genes in cluster
x_list=[] ## store number of sex-specific genes in cluster
genes=[] ## we store genes (sex-specifc gene ids)
clusters=[] ## store cluster number
## group clusters
for k,v in tmp.groupby([ 'Cluster']).indices.items():
## print(k, len(v))
clusters.append(k) ## store cluster number
clust_genes=set(tmp.index[v].to_list()) ## genes in the cluster
sex_gene_in_clust= set(sex_gene_list)& clust_genes ## how many sex-specific genes are found in cluster
## how many are in phenoype
M=M ## total genes
N=len(sex_gene_list) ## sex-specific genes
n=len(clust_genes) ## total number of cluster genes
rv = hypergeom(M, n, N) ## hypergeometric distributions
x=len(sex_gene_in_clust) ## number of sex-specific genes in cluster
## for p-value we need to get summation of all probalities greater than > x
pval= 1-rv.cdf(x)
pvals.append(pval)
n_list.append(n)
x_list.append(x)
genes.append(', '.join(sex_gene_in_clust))
fdr=mtest.multipletests(pvals, alpha=0.05, method='fdr_bh')
enrich={'Cluster':clusters, 'pvals':pvals,'cluster_size':n_list,'# of genes found in cluster':x_list,'genes':genes,'FDR':fdr[1]}
## create enrichment table
enrich_df=pd.DataFrame.from_dict(enrich)
enrich_soreted=enrich_df.sort_values(by=['pvals'],ascending=True)
enrich_soreted.to_csv(outfile,sep='\t',index=None)
def enrich_cluster_final():
''' Calculate p-value and FDR using enrichment analysis. We used hypergeometric test'''
### input file (provided by Oliver): this file has 3 columns
# First column: 'new gene ID'
# Second column: 'Cluster'
# Third column: 'cons phenotype'
##
#input_file=current_folder+'/Kasia new cluster enrichment for Vikash.txt'
#df=pd.read_csv(input_file,sep='\t')## input file as a dataframe
df = r.input_for_enrichment
df
#df=df.fillna('NA') ## nan is fill with NA
# df['consensus phenotype']=df['consensus phenotype'].str.replace('None','NA')
tmp=df.copy() ## this is the temperory data frame same as a original dataframe
tmp.set_index('new gene ID',inplace=True) ## make gene ids as index
## seprate the dataframes according sex-specific phenotypes
male_df=tmp[(tmp['cons phenotype']== 'CITH')]
female_df=tmp[(tmp['cons phenotype']== 'DOZI')]
both_df=tmp[(tmp['cons phenotype']== 'CITH_and_DOZI')]
## enrichment analysis for male
outfile=current_folder+'/../data_to_export/module_enrichment_results/Module_enrichment_guerreiro_cith.txt'
#First argumnet: temperory dataframe
#Second argument: list of male-specific genes
#Third argumnet: file where we store enrichment analysis
apply_enrich(tmp,male_df.index.to_list(),outfile)
## enrichment analysis for female: similar as male
outfile=current_folder+'/../data_to_export/module_enrichment_results/Module_enrichment_guerreiro_dozi.txt'
apply_enrich(tmp ,female_df.index.to_list(),outfile)
## enrichment analysis for both sexes: : similar as male
outfile=current_folder+'/../data_to_export/module_enrichment_results/Module_enrichment_guerreiro_both.txt'
apply_enrich(tmp,both_df.index.to_list(),outfile)
if __name__ == '__main__':
enrich_cluster_final()Essential genes
Find out how many of the genes in each module has an asexual blood-stage phenotype gene
essential_genes <- read.csv(file = "../data/Reference/bushell_2017_data.csv", header = TRUE)
## extract info
essential_genes <- essential_genes[, c("P..berghei.current.ID", "Phenotype" )]
names(essential_genes) <- c("id", "phenotype")
## change the underscore to a dash
essential_genes$id <- gsub("_", "-", essential_genes$id)
dim(essential_genes)[1] 2566 2essential_genes <-
read.csv(file = "../data/Reference/bushell_2017_data.csv", header = TRUE)
## extract info
essential_genes <- essential_genes[, c("P..berghei.current.ID", "Phenotype" )]
names(essential_genes) <- c("id", "phenotype")
## change the underscore to a dash
essential_genes$id <- gsub("_", "-", essential_genes$id)
## remove any transcript numbers
#essential_genes$id <- sub("\\..*", "", essential_genes$id)
## find out which modules all screened genes are in
df_screened_gene_modules <- gene_module_df_sex[which(gene_module_df_sex$id %in% essential_genes$id),]
print("total genes screened in this module")[1] "total genes screened in this module"table(df_screened_gene_modules$module)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
179 149 133 115 109 110 106 112 102 95 83 79 80 63 74 64 60 55 52 47 42 32 23 ## extract 3 main phenotypes - there are only two fast genes, and 13 Insufficient data
e_genes <- essential_genes[essential_genes$phenotype == "Essential", ]$id
s_genes <- essential_genes[essential_genes$phenotype == "Slow", ]$id
d_genes <- essential_genes[essential_genes$phenotype == "Dispensable", ]$id
## find out which modules they are in
e_genes_gene_modules <- gene_module_df_sex[which(gene_module_df_sex$id %in% e_genes),]
print("essential genes by module")[1] "essential genes by module"table(e_genes_gene_modules$module)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
49 84 62 62 17 62 53 47 67 56 32 52 26 30 16 33 40 17 22 20 16 10 10 s_genes_gene_modules <- gene_module_df_sex[which(gene_module_df_sex$id %in% s_genes),]
print("slow genes by module")[1] "slow genes by module"table(s_genes_gene_modules$module)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
19 28 14 25 15 27 24 16 14 22 16 14 18 12 6 12 9 8 9 8 12 4 4 d_genes_gene_modules <- gene_module_df_sex[which(gene_module_df_sex$id %in% d_genes),]
print("dispensible genes by module")[1] "dispensible genes by module"table(d_genes_gene_modules$module)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
110 37 55 27 76 20 28 49 20 17 35 13 36 21 52 18 10 30 21 19 13 18 9 ## make a combined table with this info
pc_screened <- data.frame(essential = table(e_genes_gene_modules$module),
slow = table(s_genes_gene_modules$module),
dispensible = table(d_genes_gene_modules$module),
screened = table(df_screened_gene_modules$module))[,-c(3, 5, 7)]
names(pc_screened) <- c("module", "essential", "slow", "dispensible", "screened")
pc_screened$pc_e <- (pc_screened$essential /pc_screened$screened)*100
pc_screened$pc_s <- (pc_screened$slow /pc_screened$screened)*100
pc_screened$pc_d <- (pc_screened$dispensible /pc_screened$screened)*100
## change row order:
row.order <- c("10", "9", "17", "4", "2", "6", "12", "14",
"21", "7",
"22", "23","13","16", "18", "19", "11", "15", "5",
"20", "8", "3", "1"
)
## change the module to a string
#pc_screened$module <- as.numeric(as.character(pc_screened$module))
#pc_screened$module <- as.factor(pc_screened$module)
#pc_screened <- pc_screened[match(row.order, pc_screened$module), ]
pc_screened$module <- factor(pc_screened$module, levels = rev(c("10", "9", "17", "4", "2", "6", "12", "14",
"21", "7",
"22", "23","13","16", "18", "19", "11", "15", "5",
"20", "8", "3", "1"
)))
library(scales) # For the percent_format() function
Attaching package: ‘scales’
The following object is masked from ‘package:viridis’:
viridis_pal h1 <- ggplot(data = pc_screened, mapping = aes(x = module, fill=pc_e)) +
geom_bar(col = "#FFFFFF", width = 1)+
theme_void() +
theme(panel.spacing.x = unit(1, "mm")) +
scale_fill_continuous_sequential(palette = "Reds", labels = percent_format(scale = 1), limits=c(0,100)) +
coord_flip()
legend <- get_legend(h1)
h1 <- h1 + theme(legend.position = "none")
h2 <- ggplot(data = pc_screened, mapping = aes(x = module, fill=pc_s)) +
geom_bar(col = "#FFFFFF", width = 1)+
theme_void() +
theme(panel.spacing.x = unit(1, "mm")) +
scale_fill_continuous_sequential(palette = "Reds", labels = percent_format(scale = 1), limits=c(0,100)) +
coord_flip()
legend_2 <- get_legend(h2)
h2 <- h2 + theme(legend.position = "none")
h3 <- ggplot(data = pc_screened, mapping = aes(x = module, fill=pc_d)) +
geom_bar(col = "#FFFFFF", width = 1)+
theme_void() +
theme(panel.spacing.x = unit(1, "mm")) +
scale_fill_continuous_sequential(palette = "Reds", labels = percent_format(scale = 1), limits=c(0,100)) +
coord_flip()
legend_3 <- get_legend(h3 + theme(legend.position = "bottom", legend.box.margin = margin(0, 0, 0, 12)))
h3 <- h3 + theme(legend.position = "none")
## add some space to the left of the legend as: https://wilkelab.org/cowplot/articles/shared_legends.html
#legend <- legend + theme(legend.box.margin = margin(0, 0, 0, 12))
bloodstage_annotation <- plot_grid(h1,h2,h3, nrow = 1, rel_widths = c(1,1,1))
bloodstage_annotation <- plot_grid(bloodstage_annotation,legend_3, nrow = 2, rel_heights = c(3,1))
bloodstage_annotation
ggsave("../images_to_export/bloodstage_annotation.png", plot = bloodstage_annotation, device = "png", path = NULL, scale = 1, width = 10, height = 10, units = "cm", dpi = 300, limitsize = TRUE)set up df for python
## read in modules
modules <- as.data.frame(gene_module_df_sex)
## take cols of interest
modules <- modules[ ,c("id", "module"), drop = FALSE]
## change the underscore to a dash
modules$id <- gsub("-", "_", modules$id)
## read in phenotypes from screen
essential_genes <-
read.csv(file = "../data/Reference/bushell_2017_data.csv", header = TRUE)
## extract info
essential_genes <- essential_genes[, c("P..berghei.current.ID", "Phenotype" )]
names(essential_genes) <- c("id", "phenotype")
screen_hits_to_merge <- essential_genes
## merge togerther to create final df
input_for_enrichment <- merge(modules, screen_hits_to_merge, by.x = "id", by.y = "id", all.x = TRUE)
names(input_for_enrichment) <- c("new gene ID", "Cluster", "cons phenotype")
## modify to match vikash table
## remove NA values
input_for_enrichment <- input_for_enrichment[!is.na(input_for_enrichment$`cons phenotype`), ]
##clean up
rm(screen_hits_to_merge)do significance test in python - update this to R at a later date - Vikash wrote this for enrichment of screen hits in bulk data
import os
import pandas as pd
from scipy.stats import hypergeom ## for hypergeomtric distributions
import numpy as np
import statsmodels.stats.multitest as mtest ## for multiple hypothesis testing
current_folder = os.getcwd() ## current directory path
def apply_enrich(tmp,sex_gene_list,outfile):
## groupby along Phenotyepes
#First argumnet: temperory dataframe
#Second argument: list of male-specific genes
#Third argumnet: file where we store enrichment analysis
M=len(tmp.index) # total number of genes
pvals=[] # list for storing pvalues
n_list=[] # store number of genes in cluster
x_list=[] ## store number of sex-specific genes in cluster
genes=[] ## we store genes (sex-specifc gene ids)
clusters=[] ## store cluster number
## group clusters
for k,v in tmp.groupby([ 'Cluster']).indices.items():
## print(k, len(v))
clusters.append(k) ## store cluster number
clust_genes=set(tmp.index[v].to_list()) ## genes in the cluster
sex_gene_in_clust= set(sex_gene_list)& clust_genes ## how many sex-specific genes are found in cluster
## how many are in phenoype
M=M ## total genes
N=len(sex_gene_list) ## sex-specific genes
n=len(clust_genes) ## total number of cluster genes
rv = hypergeom(M, n, N) ## hypergeometric distributions
x=len(sex_gene_in_clust) ## number of sex-specific genes in cluster
## for p-value we need to get summation of all probalities greater than > x
pval= 1-rv.cdf(x)
pvals.append(pval)
n_list.append(n)
x_list.append(x)
genes.append(', '.join(sex_gene_in_clust))
fdr=mtest.multipletests(pvals, alpha=0.05, method='fdr_bh')
enrich={'Cluster':clusters, 'pvals':pvals,'cluster_size':n_list,'# of genes found in cluster':x_list,'genes':genes,'FDR':fdr[1]}
## create enrichment table
enrich_df=pd.DataFrame.from_dict(enrich)
enrich_soreted=enrich_df.sort_values(by=['pvals'],ascending=True)
enrich_soreted.to_csv(outfile,sep='\t',index=None)
def enrich_cluster_final():
''' Calculate p-value and FDR using enrichment analysis. We used hypergeometric test'''
### input file (provided by Oliver): this file has 3 columns
# First column: 'new gene ID'
# Second column: 'Cluster'
# Third column: 'cons phenotype'
##
#input_file=current_folder+'/Kasia new cluster enrichment for Vikash.txt'
#df=pd.read_csv(input_file,sep='\t')## input file as a dataframe
df = r.input_for_enrichment
df
#df=df.fillna('NA') ## nan is fill with NA
# df['consensus phenotype']=df['consensus phenotype'].str.replace('None','NA')
tmp=df.copy() ## this is the temperory data frame same as a original dataframe
tmp.set_index('new gene ID',inplace=True) ## make gene ids as index
## seprate the dataframes according sex-specific phenotypes
male_df=tmp[(tmp['cons phenotype']== 'Essential')]
female_df=tmp[(tmp['cons phenotype']== 'Dispensable')]
both_df=tmp[(tmp['cons phenotype']== 'Slow')]
## enrichment analysis for male
outfile=current_folder+'/../data_to_export/module_enrichment_results/Module_enrichment_bushell_essential.txt'
#First argumnet: temperory dataframe
#Second argument: list of male-specific genes
#Third argumnet: file where we store enrichment analysis
apply_enrich(tmp,male_df.index.to_list(),outfile)
## enrichment analysis for female: similar as male
outfile=current_folder+'/../data_to_export/module_enrichment_results/Module_enrichment_bushell_dispensable.txt'
apply_enrich(tmp ,female_df.index.to_list(),outfile)
## enrichment analysis for both sexes: : similar as male
outfile=current_folder+'/../data_to_export/module_enrichment_results/Module_enrichment_bushell_slow.txt'
apply_enrich(tmp,both_df.index.to_list(),outfile)
if __name__ == '__main__':
enrich_cluster_final()Visualise module expression
plot out modules
UMAP_modules <- plot_cells(monocle.object, genes=gene_module_df_sex %>% filter(module %in% c(1:length(levels(gene_module_df_sex$module)))),
cell_size = 2,
x = 1, y = 2,
label_cell_groups=FALSE,
scale_to_range = TRUE,
show_trajectory_graph=FALSE) +
#scale_colour_viridis_c(name = "expression", option = "C", alpha = 1) +
scale_color_continuous_sequential(palette = "Purples 2") +
coord_fixed() +
theme_void() +
theme(legend.position = "bottom", strip.text.x = element_text(size = 15))
Scale for 'colour' is already present. Adding another scale for 'colour', which will replace the existing scale.
## view
UMAP_modules
save
#ggsave("../images_to_export/GCSKO_sexbranch_umap_modules.png", plot = UMAP_modules, device = "png", path = NULL, scale = 1, width = 30, height = 30, units = "cm", dpi = 300, limitsize = TRUE)## make a dataframe of genes per module
genes_per_module <- as.data.frame(table(gene_module_df_sex$module))
## inspect
genes_per_module## A. Preparation of dataframe
## prepare custom dataframe for all cells by modules:
agg_mat_no_group <- aggregate_gene_expression(monocle.object, gene_module_df_sex, scale_agg_values = TRUE)
## B. annotations
## make an anotation
## add pt to the monocle object
monocle.object@colData$pt_sex <- as.data.frame(pseudotime(monocle.object, reduction_method = "UMAP"))[,1]
## make an annotation dataframe
anno_no_group <- data.frame(monocle.object@colData$monocle_sex, monocle.object@colData$pt_sex, as.factor(monocle.object@colData$Prediction.Spearman._Kasia), row.names = rownames(monocle.object@colData))
names(anno_no_group) <- c("Sex", "Pseudotime", "Real_time_prediction")
## make annotation colours
annotation_colours <- list(Sex = c(Male="#016c00", Female="#a52b1e", Bipotential = "#ffe400", Asexual_Early = "#0052c5"),
Pseudotime = plasma(12, direction = 1),
Real_time_prediction = c("0" = viridis(8, direction = 1)[1] ,"1" = viridis(8, direction = 1)[2] ,"4" = viridis(8, direction = 1)[3] ,"6" = viridis(8, direction = 1)[4] ,"8" = viridis(8, direction = 1)[5] ,"12" = viridis(8, direction = 1)[6] ,"18" = viridis(8, direction = 1)[7] ,"24" = viridis(8, direction = 1)[8]))
## change the order of the cols (cells) in data frame
col.order <- rownames(anno_no_group[with(anno_no_group, order(Sex, Pseudotime)), ])
agg_mat_no_group <- agg_mat_no_group[,col.order]
## reorder the rows (gene modules) in the data frame so they are in pt order
## define the order visually and using the clusters originally produced
row.order <- c("10", "9", "17", "4", "2", "6", "12", "14",
"21", "7",
"22", "23","13","16", "18", "19", "11", "15", "5",
"20", "8", "3", "1"
)
## reorder using new order
agg_mat_no_group <- agg_mat_no_group[row.order, ]
## for cuts in columns - used later to count number of cells in each cat
df_meta <- as.data.frame(monocle.object@colData)
female_cells <- rownames(df_meta[which(df_meta$monocle_sex == "Female"), ])
male_cells <- rownames(df_meta[which(df_meta$monocle_sex == "Male"), ])
bi_cells <- rownames(df_meta[which(df_meta$monocle_sex == "Bipotential"), ])
asex_cells <- rownames(df_meta[which(df_meta$monocle_sex == "Asexual_Early"), ])
rm(df_meta)
## add module and the number of cells to the row
## change names for row names to include "module " at the begining of them
labels.row <- stringr::str_c("Module ", row.names(agg_mat_no_group))
## reorder frequency so that it is matching our matrix
genes_per_module_ordered <- genes_per_module[match(row.names(agg_mat_no_group), genes_per_module$Var1), ]
## add number of cells to the rownames for the module
for(i in seq_along(genes_per_module_ordered$Freq)){
labels.row[i] <- stringr::str_c(labels.row[i]," (n = " ,genes_per_module_ordered$Freq[i], ")")
}
## C. Plotting
## plot
heatmap_main <- pheatmap::pheatmap(agg_mat_no_group,
#scale="row",
#color = diverging_hcl(100, palette = "Blue-Red 3"),
cluster_cols = FALSE,
cluster_rows = FALSE,
## others: ward.D2,
#clustering_method="complete",
scale = "none",
show_colnames = FALSE,
labels_row = labels.row,
fontsize_row = 15,
fontsize = 12,
gaps_col = c(length(asex_cells), length(c(asex_cells,bi_cells)), length(c(asex_cells,bi_cells,female_cells))),
annotation_col = anno_no_group,
annotation_colors = annotation_colours,
cutree_rows = 6
)
## view
heatmap_main
save
ggsave("../images_to_export/GCSKO_sexbranch_heatmap.png", plot = heatmap_main, device = "png", path = NULL, scale = 1, width = 21, height = 21, units = "cm", dpi = 300, limitsize = TRUE)Visualise the expression of select genes over pseudotime
## landmark genes (genes of interest)
# AP2G - PBANKA-1437500
# AP2 - PBANKA-0909600 - from poran paper
# AP2G-2 - PBANKA-1034300
#list_of_mutant_genes <- c("PBANKA-0828000", "PBANKA-1302700", "PBANKA-1447900", "PBANKA-0102400", "PBANKA-0716500", "PBANKA-1435200", "PBANKA-1418100", "PBANKA-1144800", "PBANKA-0902300", "PBANKA-0413400", "PBANKA-1454800")
## define genes to plot
list_of_genes_of_interest <- c("PBANKA-0102400", "PBANKA-0413400", "PBANKA-0716500", "PBANKA-0828000", "PBANKA-0902300", "PBANKA-1144800", "PBANKA-1302700", "PBANKA-1418100", "PBANKA-1435200", "PBANKA-1447900", "PBANKA-1454800", "PBANKA-1437500", "PBANKA-1319500", "PBANKA-0416100", "PBANKA-1034300")
## add names
names_of_genes_of_interest <- c("GCSKO-2", "GCSKO-10", "GCSKO-19", "GCSKO-3", "GCSKO-13", "GCSKO-28", "GCSKO-oom", "GCSKO-17", "GCSKO-20", "GCSKO-29", "GCSKO-21", "AP2-G", "CCP2", "MG1", "AP2-G2")
##make df for genes of interest
genes_of_interest <- data.frame(gene = list_of_genes_of_interest, group = c(1:length(list_of_genes_of_interest)), name = names_of_genes_of_interest)
## reorder
#genes_of_interest <- genes_of_interest[match(c("AP2-G", "CCP2", "GCSKO-21", "GCSKO-17", "GCSKO-2", "MG1", "GCSKO-20", "GCSKO-3", "GCSKO-oom", "GCSKO-29", "GCSKO-10", "GCSKO-28", "GCSKO-19", "GCSKO-13"), genes_of_interest$name), ]
## prepare custom dataframe for all cells by modules:
agg_mat_genes_of_interest <- aggregate_gene_expression(monocle.object, genes_of_interest[,1:2], scale_agg_values = FALSE)
## reorder using new order
agg_mat_genes_of_interest <- agg_mat_genes_of_interest[,col.order]
## plot
heatmap_plot <- pheatmap::pheatmap(agg_mat_genes_of_interest,
#scale="row",
cluster_cols = FALSE,
cluster_rows = TRUE,
clustering_method="ward.D2",
show_colnames = FALSE,
labels_row = as.character(genes_of_interest[,3]),
gaps_col = c(length(asex_cells), length(c(asex_cells,bi_cells)), length(c(asex_cells,bi_cells,female_cells))),
#gaps_row = c(1, 6),
cutree_rows = 3,
## trying to fix legend issue here
#fontsize_row = 10,
#fontsize_col = 3,
#cellheight=3,
#cellwidth = 3,
legend = TRUE,
annotation_legend = FALSE,
annotation_col = anno_no_group,
annotation_colors = annotation_colours
)
heatmap_plot
investigate specific modules
## rename df
df_screen_hits_selected_module <- as.data.frame(gene_module_df_sex[gene_module_df_sex$module == "20", ])
## merge dfs together
module_20_annotated <- merge(gene_annotations, df_screen_hits_selected_module,by.x = "Gene.ID", by.y = "id")
## view
View(module_20_annotated)4. Mapping on mutants
pca plots
DimPlot(tenx.justwt.integrated.sex, reduction = 'pca', group.by = 'monocle_sex')
Seurat method
pancreas.anchors <- FindTransferAnchors(reference = seurat.object, query = SMARTSEQ,
dims = 1:30)
predictions <- TransferData(anchorset = pancreas.anchors, refdata = seurat.object$monocle_sex,
dims = 1:30)
pancreas.query <- AddMetaData(pancreas.query, metadata = predictions)Final Figures
## C
## This shows the cells selected for module analysis
## this package allows easy extraction of viridis values used in the pt plots
library("colourvalues") # allows
## extract colour hex values
monocle.object@colData$pt_sex_col <- colour_values(monocle.object@colData$pt_sex, palette = "plasma")
## load in the whole dataset if you haven't already loaded it in
#tenx.justwt.integrated <- readRDS("../data_to_export/tenx.justwt.integrated.RDS")
## extract metadata
df_plot <- tenx.justwt.integrated@meta.data
## add umap - merge on row names and then make sure row names are not dropped or added
df_plot <- transform(merge(df_plot, tenx.justwt.integrated@reductions[["umap"]]@cell.embeddings, by=0, all=TRUE), row.names=Row.names, Row.names=NULL)
## make new col for colours - and make everything grey
df_plot$hex <- "#e7e7e7"
## extract colours for highlighted cells
df_plot_2 <- as.data.frame(monocle.object@colData[,"pt_sex_col", drop = FALSE])
## then merge this back into the colour column, whilst matching the rows
rownames_to_match <- rownames(df_plot[rownames(df_plot) %in% rownames(df_plot_2), ])
df_plot$hex[rownames(df_plot) %in% rownames(df_plot_2)] <- df_plot_2[match(rownames_to_match, rownames(df_plot_2)), , drop = FALSE][ ,1]
### make character so ggplto2 recognises them
df_plot$hex <- as.character(df_plot$hex)
## reorder so that the voloured points are on top
## this is a bit hacky but you can split the data frame and then remerge, since the command commented out will still put E above other values - this command was just order by the col hex
df_plot_1 <- df_plot[!(df_plot$hex == "#e7e7e7"), ]
df_plot_2 <- df_plot[(df_plot$hex == "#e7e7e7"), ]
df_plot <- rbind(df_plot_2, df_plot_1)
rm(df_plot_2, df_plot_1)
## add tree
##The tree for monocle is located here:
# monocle.object@principal_graph_aux[["UMAP"]]$dp_mst
ica_space_df <- t(monocle.object@principal_graph_aux[["UMAP"]]$dp_mst) %>%
as.data.frame() %>%
dplyr::select_(prin_graph_dim_1 = "UMAP_1", prin_graph_dim_2 = "UMAP_2") %>%
dplyr::mutate(sample_name = rownames(.),
sample_state = rownames(.))
dp_mst <- monocle.object@principal_graph[["UMAP"]]
edge_df <- dp_mst %>%
igraph::as_data_frame() %>%
dplyr::select_(source = "from", target = "to") %>%
dplyr::left_join(ica_space_df %>%
dplyr::select_(
source="sample_name",
source_prin_graph_dim_1="prin_graph_dim_1",
source_prin_graph_dim_2="prin_graph_dim_2"),
by = "source") %>%
dplyr::left_join(ica_space_df %>%
dplyr::select_(
target="sample_name",
target_prin_graph_dim_1="prin_graph_dim_1",
target_prin_graph_dim_2="prin_graph_dim_2"),
by = "target")
umap_zoom_plot <- ggplot(df_plot, aes(x = UMAP_1, y = UMAP_2, colour = hex)) +
geom_point(size = 2) +
## need this to tell ggplot2 to map to values
scale_colour_identity() +
## fix coordinates
coord_fixed() +
theme_void() +
theme(legend.position = "none") +
geom_segment(aes_string(x="source_prin_graph_dim_1",
y="source_prin_graph_dim_2",
xend="target_prin_graph_dim_1",
yend="target_prin_graph_dim_2"
),
data=edge_df, inherit.aes = FALSE
)
umap_zoom_plot
## remove big dataset
#rm(tenx.justwt.integrated)# Extract the legend. Returns a gtable
leg <- get_legend(umap_pt)
# Convert to a ggplot and print
legend_d <- as_ggplot(leg)
legend_d
save
ggsave("../images_to_export/Figure_D.png", plot = umap_zoom_plot, device = "png", path = NULL, scale = 1, width = 21, height = 29.7, units = "cm", dpi = 300, limitsize = TRUE)
ggsave("../images_to_export/Figure_D_legend.png", plot = legend_d, device = "png", path = NULL, scale = 1, width = 21, height = 29.7, units = "cm", dpi = 300, limitsize = TRUE)## C
## This shows the cells selected for module analysis
## this package allows easy extraction of viridis values used in the pt plots
library("colourvalues") # allows
## extract colour hex values
monocle.object@colData$rt_sex_col <- colour_values(monocle.object@colData$Prediction.Spearman., palette = "viridis")
## load in the whole dataset if you haven't already loaded it in
#tenx.justwt.integrated <- readRDS("../data_to_export/tenx.justwt.integrated.RDS")
## extract metadata
df_plot <- tenx.justwt.integrated@meta.data
## add umap - merge on row names and then make sure row names are not dropped or added
df_plot <- transform(merge(df_plot, tenx.justwt.integrated@reductions[["umap"]]@cell.embeddings, by=0, all=TRUE), row.names=Row.names, Row.names=NULL)
## make new col for colours - and make everything grey
df_plot$hex <- "#e7e7e7"
## extract colours for highlighted cells
df_plot_2 <- as.data.frame(monocle.object@colData[,"rt_sex_col", drop = FALSE])
## then merge this back into the colour column, whilst matching the rows
rownames_to_match <- rownames(df_plot[rownames(df_plot) %in% rownames(df_plot_2), ])
df_plot$hex[rownames(df_plot) %in% rownames(df_plot_2)] <- df_plot_2[match(rownames_to_match, rownames(df_plot_2)), , drop = FALSE][ ,1]
### make character so ggplto2 recognises them
df_plot$hex <- as.character(df_plot$hex)
## reorder so that the voloured points are on top
## this is a bit hacky but you can split the data frame and then remerge, since the command commented out will still put E above other values - this command was just order by the col hex
df_plot_1 <- df_plot[!(df_plot$hex == "#e7e7e7"), ]
df_plot_2 <- df_plot[(df_plot$hex == "#e7e7e7"), ]
df_plot <- rbind(df_plot_2, df_plot_1)
rm(df_plot_2, df_plot_1)
umap_zoom_plot_rt <- ggplot(df_plot, aes(x = UMAP_1, y = UMAP_2, colour = hex)) +
geom_point(size = 2) +
## need this to tell ggplot2 to map to values
scale_colour_identity(guide = "legend") +
## fix coordinates
coord_fixed()
# Extract the legend. Returns a gtable
leg <- get_legend(umap_zoom_plot_rt)
# Convert to a ggplot and print
legend_d <- as_ggplot(leg)
legend_d
umap_zoom_plot_rt+theme(legend.position = "none") +
theme_void()
## remove big dataset
#rm(tenx.justwt.integrated)
save
ggsave("../images_to_export/UMAP_sex_id.png", plot = umap_zoom_plot_rt, device = "png", path = NULL, scale = 1, width = 21, height = 29.7, units = "cm", dpi = 300, limitsize = TRUE)# 1 = blue - "#0052c5"
# 2 = red - "#a52b1e"
# 3 = green - "#016c00"
# 4 = yellow - "#ffe400"
#pal_sex <- c("#0052c5","#ffe400", "#a52b1e", "#016c00")
## extract pseudotime numbers and identity of cells to a dataframe
df_pt_id <- as.data.frame(monocle.object@colData[,c("pt_sex", "monocle_sex")])
## inspect possible values
list_of_sexes <- names(table(df_pt_id$monocle_sex))
## make a new column
df_pt_id$colour <- NA
## make colour ramps
asex_ramp <- colorRampPalette(c("#D5E3F5", "#0052c5"))
male_ramp <- colorRampPalette(c("#ABDDBF", "#016c00"))
female_ramp <- colorRampPalette(c("#F4C1BE", "#a52b1e"))
bipot_ramp <- colorRampPalette(c("white", "#ffe400"))
## re-classify the cells that are unassigned cells removed from sexual branch above:
#df_pt_id[which(rownames(df_pt_id) %in% remove_cells), ]$monocle_sex <- "Asexual"
## assign values to each cluster
## help here: https://stackoverflow.com/questions/9946630/colour-points-in-a-plot-differently-depending-on-a-vector-of-values
df_pt_id[df_pt_id$monocle_sex == "Asexual_Early" | df_pt_id$monocle_sex == "Asexual_Late", ]$colour <- asex_ramp(100)[as.numeric(cut(df_pt_id[df_pt_id$monocle_sex == "Asexual_Early" | df_pt_id$monocle_sex == "Asexual_Late", ]$pt_sex,breaks = 100))]
df_pt_id[df_pt_id$monocle_sex == "Male", ]$colour <- male_ramp(100)[as.numeric(cut(df_pt_id[df_pt_id$monocle_sex == "Male", ]$pt_sex,breaks = 100))]
df_pt_id[df_pt_id$monocle_sex == "Female", ]$colour <- female_ramp(100)[as.numeric(cut(df_pt_id[df_pt_id$monocle_sex == "Female", ]$pt_sex,breaks = 100))]
df_pt_id[df_pt_id$monocle_sex == "Bipotential", ]$colour <- bipot_ramp(100)[as.numeric(cut(df_pt_id[df_pt_id$monocle_sex == "Bipotential", ]$pt_sex,breaks = 100))]
## ADD TO BIG OBJECT
## extract metadata
df_plot <- tenx.justwt.integrated@meta.data
## add umap - merge on row names and then make sure row names are not dropped or added
df_plot <- transform(merge(df_plot, tenx.justwt.integrated@reductions[["umap"]]@cell.embeddings, by=0, all=TRUE), row.names=Row.names, Row.names=NULL)
## make new col for colours - and make everything grey
df_plot$hex <- "#e7e7e7"
## extract colours for highlighted cells
df_plot_2 <- as.data.frame(df_pt_id[,"colour", drop = FALSE])
## then merge this back into the colour column, whilst matching the rows
rownames_to_match <- rownames(df_plot[rownames(df_plot) %in% rownames(df_plot_2), ])
df_plot$hex[rownames(df_plot) %in% rownames(df_plot_2)] <- df_plot_2[match(rownames_to_match, rownames(df_plot_2)), , drop = FALSE][ ,1]
### make character so ggplto2 recognises them
df_plot$hex <- as.character(df_plot$hex)
## reorder so that the voloured points are on top
## this is a bit hacky but you can split the data frame and then remerge, since the command commented out will still put E above other values - this command was just order by the col hex
df_plot_1 <- df_plot[!(df_plot$hex == "#e7e7e7"), ]
df_plot_2 <- df_plot[(df_plot$hex == "#e7e7e7"), ]
df_plot <- rbind(df_plot_2, df_plot_1)
rm(df_plot_2, df_plot_1)
## make ggplot
umap_id_pt <- ggplot(df_plot, aes(x = UMAP_1, y = UMAP_2)) +
geom_point(col = df_plot$hex) +
theme_void() +
coord_fixed()
umap_id_pt
save
ggsave("../images_to_export/UMAP_sex_id_pt.png", plot = umap_id_pt, device = "png", path = NULL, scale = 1, width = 21, height = 29.7, units = "cm", dpi = 300, limitsize = TRUE)save modules
## modules are located in this object:
# gene_module_df_sex
write.csv(gene_module_df_sex, file = "../data_to_export/gene_module_df_sex.csv")Appendix
Session Info
R version 4.0.3 (2020-10-10)
Platform: x86_64-apple-darwin17.0 (64-bit)
Running under: macOS Catalina 10.15.7
Matrix products: default
BLAS: /System/Library/Frameworks/Accelerate.framework/Versions/A/Frameworks/vecLib.framework/Versions/A/libBLAS.dylib
LAPACK: /Library/Frameworks/R.framework/Versions/4.0/Resources/lib/libRlapack.dylib
locale:
[1] en_GB.UTF-8/en_GB.UTF-8/en_GB.UTF-8/C/en_GB.UTF-8/en_GB.UTF-8
attached base packages:
[1] stats4 parallel grid stats graphics grDevices utils datasets methods base
other attached packages:
[1] scales_1.1.1 scmap_1.10.0 latex2exp_0.4.0 colourvalues_0.3.7
[5] readxl_1.3.1 destiny_3.2.0 circlize_0.4.12 gganimate_1.0.7
[9] shiny_1.5.0 monocle3_0.2.3.0 SingleCellExperiment_1.10.1 SummarizedExperiment_1.18.2
[13] DelayedArray_0.14.1 matrixStats_0.57.0 GenomicRanges_1.40.0 GenomeInfoDb_1.24.2
[17] IRanges_2.22.2 S4Vectors_0.26.1 Biobase_2.48.0 BiocGenerics_0.34.0
[21] Nebulosa_1.2.0 reshape2_1.4.4 Hmisc_4.4-1 Formula_1.2-4
[25] survival_3.2-7 lattice_0.20-41 gridExtra_2.3 dplyr_1.0.2
[29] patchwork_1.0.1 ggplot2bdc_0.3.2 cowplot_1.1.0 ggpubr_0.4.0
[33] ggplot2_3.3.2 viridis_0.5.1 viridisLite_0.3.0 Seurat_3.2.2
[37] colorspace_1.4-1
loaded via a namespace (and not attached):
[1] ggthemes_4.2.4 coda_0.19-4 tidyr_1.1.2 knitr_1.30
[5] irlba_2.3.3 data.table_1.13.2 rpart_4.1-15 RCurl_1.98-1.2
[9] generics_0.0.2 callr_3.5.1 leidenbase_0.1.2 usethis_1.6.3
[13] RANN_2.6.1 proxy_0.4-24 future_1.19.1 spatstat.data_1.4-3
[17] httpuv_1.5.4 assertthat_0.2.1 gifski_0.8.6 xfun_0.18
[21] hms_0.5.3 evaluate_0.14 promises_1.1.1 DEoptimR_1.0-8
[25] fansi_0.4.1 progress_1.2.2 DBI_1.1.0 igraph_1.2.6
[29] htmlwidgets_1.5.2 spdep_1.1-5 purrr_0.3.4 ellipsis_0.3.1
[33] RSpectra_0.16-0 crosstalk_1.1.0.1 ks_1.12.0 backports_1.1.10
[37] deldir_0.1-29 vctrs_0.3.4 TTR_0.24.2 remotes_2.2.0
[41] ROCR_1.0-11 abind_1.4-5 RcppEigen_0.3.3.7.0 withr_2.3.0
[45] grr_0.9.5 robustbase_0.93-7 googleVis_0.6.10 checkmate_2.0.0
[49] vcd_1.4-8 sctransform_0.3.1 xts_0.12.1 prettyunits_1.1.1
[53] mclust_5.4.7 goftest_1.2-2 cluster_2.1.0 lazyeval_0.2.2
[57] laeken_0.5.1 crayon_1.3.4 units_0.6-7 slam_0.1-47
[61] pkgconfig_2.0.3 labeling_0.4.2 tweenr_1.0.1 nlme_3.1-149
[65] pkgload_1.1.0 nnet_7.3-14 devtools_2.3.2 rlang_0.4.8
[69] globals_0.13.1 lifecycle_0.2.0 miniUI_0.1.1.1 rsvd_1.0.3
[73] randomForest_4.6-14 cellranger_1.1.0 rprojroot_1.3-2 polyclip_1.10-0
[77] RcppHNSW_0.3.0 lmtest_0.9-38 Matrix_1.2-18 raster_3.3-13
[81] carData_3.0-4 Matrix.utils_0.9.8 boot_1.3-25 zoo_1.8-8
[85] base64enc_0.1-3 ggridges_0.5.2 GlobalOptions_0.1.2 processx_3.4.4
[89] pheatmap_1.0.12 png_0.1-7 bitops_1.0-6 KernSmooth_2.23-17
[93] DelayedMatrixStats_1.10.1 classInt_0.4-3 shape_1.4.5 stringr_1.4.0
[97] jpeg_0.1-8.1 rstatix_0.6.0 ggsignif_0.6.0 memoise_1.1.0
[101] magrittr_2.0.1 plyr_1.8.6 hexbin_1.28.1 ica_1.0-2
[105] gdata_2.18.0 zlibbioc_1.34.0 compiler_4.0.3 RColorBrewer_1.1-2
[109] pcaMethods_1.80.0 fitdistrplus_1.1-1 cli_2.1.0 LearnBayes_2.15.1
[113] XVector_0.28.0 listenv_0.8.0 pbapply_1.4-3 ps_1.4.0
[117] htmlTable_2.1.0 ggplot.multistats_1.0.0 MASS_7.3-53 mgcv_1.8-33
[121] tidyselect_1.1.0 stringi_1.5.3 forcats_0.5.0 yaml_2.2.1
[125] latticeExtra_0.6-29 ggrepel_0.8.2 pbmcapply_1.5.0 tools_4.0.3
[129] future.apply_1.6.0 rio_0.5.16 rstudioapi_0.11 foreign_0.8-80
[133] smoother_1.1 scatterplot3d_0.3-41 farver_2.0.3 Rtsne_0.15
[137] digest_0.6.27 BiocManager_1.30.10 Rcpp_1.0.6 car_3.0-10
[141] broom_0.7.2 later_1.1.0.1 RcppAnnoy_0.0.16 httr_1.4.2
[145] sf_0.9-6 fs_1.5.0 tensor_1.5 ranger_0.12.1
[149] reticulate_1.18 splines_4.0.3 uwot_0.1.8 expm_0.999-5
[153] spatstat.utils_1.17-0 sp_1.4-4 spData_0.3.8 plotly_4.9.2.1
[157] sessioninfo_1.1.1 xtable_1.8-4 jsonlite_1.7.1 spatstat_1.64-1
[161] testthat_2.3.2 R6_2.5.0 gmodels_2.18.1 pillar_1.4.6
[165] htmltools_0.5.1.1 mime_0.9 glue_1.4.2 fastmap_1.0.1
[169] VIM_6.1.0 class_7.3-17 codetools_0.2-16 utf8_1.1.4
[173] pkgbuild_1.1.0 mvtnorm_1.1-1 tibble_3.0.4 curl_4.3
[177] leiden_0.3.3 gtools_3.8.2 zip_2.1.1 openxlsx_4.2.2
[181] limma_3.44.3 rmarkdown_2.5 desc_1.2.0 munsell_0.5.0
[185] e1071_1.7-4 GenomeInfoDbData_1.2.3 haven_2.3.1 gtable_0.3.0 Scaling values in the aggregated heatmap
getAnywhere(aggregate_gene_expression)A single object matching ‘aggregate_gene_expression’ was found
It was found in the following places
package:monocle3
namespace:monocle3
with value
function (cds, gene_group_df = NULL, cell_group_df = NULL, norm_method = c("log",
"binary", "size_only"), pseudocount = 1, scale_agg_values = TRUE,
max_agg_value = 3, min_agg_value = -3, exclude.na = TRUE)
{
if (is.null(gene_group_df) && is.null(cell_group_df))
stop("Error: one of either gene_group_df or cell_group_df must not be NULL")
agg_mat <- normalized_counts(cds, norm_method = norm_method,
pseudocount = pseudocount)
if (is.null(gene_group_df) == FALSE) {
gene_group_df <- as.data.frame(gene_group_df)
gene_group_df <- gene_group_df[gene_group_df[, 1] %in%
fData(cds)$gene_short_name | gene_group_df[, 1] %in%
row.names(fData(cds)), , drop = FALSE]
short_name_mask <- gene_group_df[[1]] %in% fData(cds)$gene_short_name
if (any(short_name_mask)) {
geneids <- as.character(gene_group_df[[1]])
geneids[short_name_mask] <- row.names(fData(cds))[match(geneids[short_name_mask],
fData(cds)$gene_short_name)]
gene_group_df[[1]] <- geneids
}
agg_mat = as.matrix(my.aggregate.Matrix(agg_mat[gene_group_df[,
1], ], as.factor(gene_group_df[, 2]), fun = "sum"))
if (scale_agg_values) {
agg_mat <- t(scale(t(agg_mat)))
agg_mat[agg_mat < min_agg_value] <- min_agg_value
agg_mat[agg_mat > max_agg_value] <- max_agg_value
}
}
if (is.null(cell_group_df) == FALSE) {
cell_group_df <- as.data.frame(cell_group_df)
cell_group_df <- cell_group_df[cell_group_df[, 1] %in%
row.names(pData(cds)), , drop = FALSE]
agg_mat <- agg_mat[, cell_group_df[, 1]]
agg_mat <- my.aggregate.Matrix(Matrix::t(agg_mat), as.factor(cell_group_df[,
2]), fun = "mean")
agg_mat <- Matrix::t(agg_mat)
}
if (exclude.na) {
agg_mat <- agg_mat[rownames(agg_mat) != "NA", colnames(agg_mat) !=
"NA", drop = FALSE]
}
return(agg_mat)
}
<bytecode: 0x7ff952617628>
<environment: namespace:monocle3>agg_mat = as.matrix(monocle3::my.aggregate.Matrix(agg_mat[gene_group_df[,1], ], as.factor(gene_group_df[, 2]), fun = "sum"))
Error in h(simpleError(msg, call)) :
error in evaluating the argument 'x' in selecting a method for function 'as.matrix': 'my.aggregate.Matrix' is not an exported object from 'namespace:monocle3'## get an idea of the spread of z-score values
# test <- (agg_mat_no_group)
# rowRanges(test)
# rowMeans(test)
# test <- t(agg_mat_no_group)
# names(test) = make.names(test)
# test = melt(test)
# ggplot(test, aes(x = Var2, y = value, group = Var2)) + geom_violin()
# rm(test)In conclusion, the plots will look different if scaling is done by heatmap as it does not do the relimiting - i.e. anything < -3 and 3 < for the z-scores. the scaling is done on the transformed columns (e.g. when applying ‘scale’ to a matrix, it does it in a column-wise manner) which in this case, the modules are columns and so it does the correct scaling required. This is because the input is normalised cell counts and so the cells have already been scaled.
enrichment analysis in R first try
didn’t work
## this was derived from an answer here: https://stackoverflow.com/questions/64969842/how-to-calculate-hypergeometric-test-for-each-row-in-data-frame-with-bonferroni
## the test dataset
# Total_mRNAs = Total_genes_in_screen = N (constant)
# subset_mRNAs = Total_hits_in_screen = n (constant)
# Total_targets_targets = Total_genes_in_module = K
# subset_targets = Hits_in_module = k
# Total_genes_in_screen <- nrow(screen_hits[!is.na(screen_hits$`Gam phenotype screen`), ])
# ## this is if you take the screened genes in the cluster
# #Total_genes_in_screen <- as.data.frame(pc_screened$screened)
# Total_hits_in_screen <- nrow(screen_hits[which(screen_hits$`Gam phenotype screen` == "Both" | screen_hits$`Gam phenotype screen` == "Females" | screen_hits$`Gam phenotype screen` == "Males"), ] )
# Hits_in_module <- as.data.frame(table(df_hits_gene_modules$module))$Freq
# Total_genes_in_module <- as.data.frame(table(gene_module_df_sex$module))$Freq
# Module_names <- as.data.frame(table(gene_module_df_sex$module))$Var1
#
# df1 <- data.frame(Module_names = Module_names, Total_genes_in_module = Total_genes_in_module, Hits_in_module = Hits_in_module, Total_hits_in_screen = rep(Total_hits_in_screen, length(Module_names)), Total_genes_in_screen = rep(Total_genes_in_screen, length(Module_names)))
#
# library(broom)
# result = lapply(1:nrow(df1),function(i){
# not_target_subset = df1$Total_genes_in_module[i] - df1$Hits_in_module[i]
# not_subset = df1$Total_genes_in_screen[i] - df1$Total_hits_in_screen[i] - not_target_subset
#
#
# M = cbind(c(df1$Hits_in_module[i],df1$Total_hits_in_screen[i]-df1$Hits_in_module[i]),
# c(not_target_subset,not_subset))
#
# res = data.frame(Module_names=df1$Module_names[i],
# tidy(fisher.test(M,alternative="greater")))
#
# return(res)
# })
#
# ## bind everything together
# result = do.call(rbind,result)
# ## Adjust p value using bonferoni multiple hypothesis correction
# result$padj = p.adjust(result$p.value,"bonferroni")
#
# 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